
支持與應(yīng)用
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【色譜知識(shí)分享】HPLC常見(jiàn)問(wèn)題討論
發(fā)布時(shí)間:
2024-09-06
HPLC常見(jiàn)問(wèn)題
分析與討論
我們?cè)谶M(jìn)行高效液相色譜實(shí)驗(yàn)時(shí)常常會(huì)遇見(jiàn)各種峰型問(wèn)題,例如峰拖尾、峰展寬等,除此之外還有保留異常與基線異常,影響實(shí)驗(yàn)的定量甚至定性。
為了更好解決以上問(wèn)題,掌握色譜技術(shù),本篇推文將從高效液相色譜常見(jiàn)峰型異常、保留異常與基線異常三個(gè)方面進(jìn)行討論。
1 峰型異常
實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的異常峰型有目標(biāo)峰前后有小峰、拖尾峰/峰展寬、前沿峰、負(fù)峰、肩峰(雙峰)、鬼峰等情況。
1.1 目標(biāo)峰前后有小峰
(1)樣品不純——可以通過(guò)調(diào)整色譜條件或者更換色譜柱解決;
(2)分析柱/保護(hù)柱的柱頭塌陷——該情況較為常見(jiàn),此時(shí)往往所有的峰都分裂,可以清洗或者再生色譜柱;
(3)柱容量下降——色譜柱使用較長(zhǎng)時(shí)間后,一些強(qiáng)保留的組分會(huì)吸附在柱內(nèi),可采用強(qiáng)洗脫溶劑清洗色譜柱,或者更換色譜柱;
(4)溶劑效應(yīng)——樣品溶劑與流動(dòng)相洗脫能力相差大,可更換樣品溶劑;
(5)樣品分解
1.2 拖尾峰
(1)色譜柱塌陷——更換柱子
(2)pH不合適——堿性化合物可在流動(dòng)相里添加1%左右的三乙胺,再用磷酸調(diào)回酸性**。
(3)管路沒(méi)接好——液相色譜管線的差異也會(huì)導(dǎo)致峰型變化,管線死體積大會(huì)導(dǎo)致峰拖尾,可以更換管線;
(4)濾頭堵塞、填料脫落——維修或更換色譜柱;
(5)柱子被污染——使用強(qiáng)洗脫能力的溶劑如乙腈、甲醇等清洗色譜柱;
(6)體積過(guò)載、質(zhì)量過(guò)載——一般離子型化合物與體積過(guò)載時(shí)容易產(chǎn)生寬峰,此時(shí)可在流動(dòng)相中加入三氟乙酸(TFA)。質(zhì)量過(guò)載時(shí)峰呈現(xiàn)三角狀,可適當(dāng)降低進(jìn)樣濃度或體積;
圖1 樣品質(zhì)量過(guò)載
圖2 降低進(jìn)樣量后樣品峰正常
(7)溶劑效應(yīng)——樣品溶劑與流動(dòng)相洗脫能力相差大,可更換樣品溶劑
**酸性條件下,三乙胺率先占據(jù)固定相中的高能位點(diǎn),屏蔽堿性化合物與固定相的吸附作用,從而改善峰形。但當(dāng)遇到堿性比三乙胺更強(qiáng)的堿性化合物時(shí),其作用就不明顯了
1.3 前沿峰
(1)色譜柱過(guò)載——樣品進(jìn)樣量大,可以降低進(jìn)樣量或降低樣品的濃度;
(2)流動(dòng)相pH不恰當(dāng)——調(diào)整pH
(3)柱溫低
(4)色譜柱損壞
1.4 負(fù)峰/倒峰
(1)流動(dòng)相吸附底值過(guò)高——適當(dāng)改變波長(zhǎng);
(2)進(jìn)樣時(shí)進(jìn)入了空氣——排氣;
(3)溶劑效應(yīng)——樣品溶劑與流動(dòng)相洗脫能力相差大,可更換樣品溶劑;
(4)樣品折射率小——示差檢測(cè)器的信號(hào)是折射率,當(dāng)組分折射率小于流動(dòng)相時(shí)即出現(xiàn)倒峰,可改變流動(dòng)相添加劑或改變檢測(cè)波長(zhǎng);
(5)參比波長(zhǎng)設(shè)置不合適——在二極管陣列檢測(cè)器中,設(shè)置的參比波長(zhǎng)有紫外吸收,從而導(dǎo)致色譜峰峰高降低甚至出現(xiàn)倒峰,可通過(guò)關(guān)閉參比波長(zhǎng)來(lái)解決
1.5 肩峰/雙峰
(1)樣品不純——此時(shí)只有少部分的色譜峰為肩峰,其他的色譜峰為正常的色譜峰。改變流動(dòng)相或色譜柱,選擇合適的分離條件;
(2)化合物含有特殊結(jié)構(gòu)——其在特殊條件下存在動(dòng)態(tài)平衡,此時(shí)可使用堿性流動(dòng)相或用特殊方法解決,如衍生化;
(3)色譜柱損壞——若進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)液后仍然產(chǎn)生肩峰,可以判斷是色譜柱損壞
1.6 鬼峰
(1)檢測(cè)器進(jìn)氣泡——平衡時(shí)基線規(guī)律地產(chǎn)生波動(dòng),有可能是檢測(cè)器進(jìn)氣泡了,此時(shí)可以卸下色譜柱,用甲醇/乙腈清洗系統(tǒng);
(2)上一個(gè)樣品遺留的組分影響——此時(shí)的鬼峰往往保留時(shí)間不同,可用大比例有機(jī)相沖洗5~10min
2 保留異常
2.1 保留時(shí)間短
(1)可更換色譜柱。未被鍵合的硅羥基和化合物中的極性基團(tuán)產(chǎn)生氫鍵或發(fā)生離子交換作用,使極性化合物保留增強(qiáng);
(2)加入離子對(duì)試劑。但是離子對(duì)試劑對(duì)于色譜柱的損傷較大,難以沖洗干凈,且易堵塞機(jī)器
2.2 目標(biāo)峰不保留
(1)化合物極性弱——這是比較常見(jiàn)的原因,而此時(shí)使用水/甲醇或水/乙腈體系不太容易洗脫下來(lái)。可以選擇在不流動(dòng)相中加入少量的異丙醇,增強(qiáng)流動(dòng)相的洗脫能力。
3 基線異常
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到的基線問(wèn)題一般是基線噪音高、基線漂移與基線波動(dòng),大多都是由于儀器的問(wèn)題造成的。
3.1 基線噪音過(guò)高
(1)氘燈老化——氘燈的使用時(shí)間有500、1000、2000h等,超過(guò)使用時(shí)間后可能出現(xiàn)基線噪音高的問(wèn)題,此時(shí)應(yīng)更換氘燈;
(2)檢測(cè)器流通池被污染——卸下色譜柱,用水或甲醇沖洗流通池;
(3)參數(shù)設(shè)置——有些儀器可以修改靈敏度,靈敏度越大,響應(yīng)越高,基線噪音也就越大
3.2 基線漂移
(1)平衡不充分——初次使用色譜柱時(shí)至少要用10 ~20 倍柱體積平衡色譜柱。若流動(dòng)相中含有離子對(duì)試劑或者使用HILIC模式的色譜柱應(yīng)采用50~100 倍柱體積平衡體系。示差檢測(cè)器平衡較慢,參比池和樣品池至少需要用流動(dòng)相平衡2h以上。若波長(zhǎng)過(guò)低也需延長(zhǎng)平衡時(shí)間;
(2)梯度洗脫酸度不平衡——在梯度洗脫時(shí),隨著有機(jī)相的增加,流動(dòng)相的酸度降低,使基線漂移,可以在有機(jī)相中也加入同比例的酸;
(3)氘燈老化——更換氘燈;
(4)檢測(cè)器流通池被污染——卸下色譜柱,用水或甲醇沖洗流通池
3.3 基線波動(dòng)
(1)流動(dòng)相有氣泡——停泵,重新超聲流動(dòng)相,延長(zhǎng)排氣時(shí)間;
(2)流通池進(jìn)氣泡——若基線和壓力規(guī)律波動(dòng),一般懷疑是流通池內(nèi)進(jìn)了氣泡。若為示差檢測(cè)器,可以提高廢液瓶擺放位置,增加背壓,減少氣泡產(chǎn)生幾率;
(3)單向閥堵塞——若泵長(zhǎng)時(shí)間走純乙腈或者高比例乙腈,單向閥容易堵塞,此時(shí)可以拆卸單向閥進(jìn)行超聲清洗;
(4)流動(dòng)相混合不均——流動(dòng)相通過(guò)比例閥進(jìn)行液體的混合,可以采用單泵預(yù)混的方式減少基線波動(dòng);
(5)檢測(cè)器流通池被污染——卸下色譜柱,用水或甲醇沖洗流通池
本次推文對(duì)HPLC常見(jiàn)色譜異常及其原因的進(jìn)行了多方面的分析,并提出相應(yīng)的解決方法,為液相實(shí)驗(yàn)的操作提供一定的參考及依據(jù)。
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